ABSTRACT
Resumen En el presente trabajo se seleccionaron y validaron genes de referencia para estudios transcripcionales en el modelo clavel -Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Para ello, se seleccionaron genes asociados a procesos básicos celulares que han sido usados como genes de referencia en otros modelos planta-patógeno y se determinó el efecto de la inoculación del patógeno sobre su expresión. Se realizó un diseño de cebadores para los diferentes genes candidatos con el fin de verificar tanto su presencia en el genoma de claveles cultivados en Colombia, como su transcripción constitutiva en los diferentes tejidos por medio de la técnica de transcripción reversa y posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por sus siglas en ingles). Posteriormente, se evaluaron los niveles transcripcionales de los genes candidatos usando RT-qPCR en tallos y raíces de dos variedades con diferentes niveles de resistencia a la enfermedad, que fueron inoculados con este patógeno. La validación estadística realizada, usando ANOVA y los programas GeNorm y Normfinder, determinó que los genes codificantes para una histona H3 y el ARNr18S no presentan variación en sus niveles de expresión por efecto de la inoculación, permitiendo su uso como genes de referencia en estudios transcripcionales en esta interacción planta-patógeno.
Abstract In this research, reference genes were validated for transcriptional studies in the pathosystem carnation - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associated with basic cellular processes that have been used as reference genes in other plant-pathogen models were selected and the effect of the inoculation with the pathogen on their expression was determined. For this, it was necessary to design primers for each candidate genes to check their presence in the genome of carnations grown in Colombia and their constitutive transcription in different tissues of the plant using reverse transcription subsequent polymerase chain reaction (RT-PCR). The transcriptional levels of the candidate genes were evaluated using RT-qPCR in stems and roots inoculated with this pathogen for two cultivars with different levels of resistance to the disease. According to the statistical validation carried out using ANOVA and the GeNorm and Normfinder programs, the genes coding for a histone H3 and rRNA18S did not show any significant variation in their expression levels due to inoculation, so they can be used as reference genes in transcriptional studies in this plant-pathogen interaction.
Resumo Neste trabalho foram validados genes de referencia para estudos de transcrição no modelo cravo - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Genes associados a processos básicos celulares, anteriormente usados como genes de referencia noutros modelos planta-patógeno, foram selecionados e se determinou o efeito, sobre a sua expressão, que apresentava a inoculação com o patógeno. Foi realizado um desenho de iniciadores para os diferentes genes candidatos para verificou a sua presença no genoma de cravos cultivados na Colômbia, e uma transcrição constitutiva em diferentes tecidos da planta com a técnica de transcrição reversa e posterior reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Em seguida, os níveis de transcrição dos genes candidatos foram avaliados por RT-qPCR em caules e raízes de duas variedades com diferentes níveis de resistência à doença, que tinham sido inoculados com o patógeno. A validação estatística realizada por ANOVA y com os programas GeNorm y Normfinder, permitiram determinar que os genes que codificam para uma histona H3 y para o ARNr 18S, não apresentam variação nos seus níveis de expressão por efeito da inoculação, sugerindo que podem ser usados como genes de referencia em estudos de transcrição nesta interação planta-patógeno.
ABSTRACT
El género Fusarium es ampliamente conocido por su capacidad fitopatógena, típicamente asociada al marchitamiento vascular. Sin embargo, se ha reportado como un patógeno oportunista en pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos, por lo que puede ser considerado como un microorganismo de interés en estudios de patogenicidad en diferentes hospederos. Este trabajo evaluó la capacidad patogénica de aislamientos de Fusarium spp. de diferentes orígenes en hospederos vegetales y en un hospedero animal (modelo murino). Doce aislamientos de Fusarium spp. de origen vegetal, animal superficial, humano superficial y humano sistémico fueron inoculados en plantas de tomate, gulupa y clavel, y en ratones BALB/c, inmunocompetentes e inmunosuprimidos. Las pruebas de patogenicidad en plantas no mostraron todos los síntomas asociados al marchitamiento vascular en los tres modelos vegetales, pero la colonización y la necrosis de los haces vasculares observada en todos los casos, independientemente de la especie de Fusarium y el origen del aislamiento, demostró el potencial infeccioso de Fusarium spp. en las diferentes especies de plantas. Por otro lado, las pruebas de patogenicidad en el modelo murino evidenciaron alteraciones del comportamiento. Asimismo, se observó en el modelo murino que todos los aislamientos infectaron y colonizaron diferentes órganos, independientemente de su origen, de la especie o del estado inmunitario del hospedero, pero solamente cinco (de diferente origen y correspondientes a diferentes especies) generaron mortalidad. En contraste, la prueba de inoculación superficial no evidenció lesiones ni colonización. Los resultados observados indican el potencial papel patogénico de los aislamientos de Fusarium spp. en los diferentes tipos de hospederos. Sin embargo, es necesario profundizar en estudios de factores de patogenicidad que expliquen la capacidad de este género para colonizar múltiples hospederos.
The genus Fusarium is widely recognized for its phytopathogenic capacity. However, it has been reported as an opportunistic pathogen in immunocompetent and immunocompromised patients. Thus, it can be considered a microorganism of interest in pathogenicity studies on different hosts. Therefore, this work evaluated the pathogenicity of Fusarium spp. isolates from different origins in plants and animals (murine hosts). Twelve isolates of Fusarium spp. from plants, animal superficial mycoses, and human superficial and systemic mycoses were inoculated in tomato, passion fruit and carnation plants, and in immunocompetent and immunosuppressed BALB/c mice. Pathogenicity tests in plants did not show all the symptoms associated with vascular wilt in the three plant models; however, colonization and necrosis of the vascular bundles, regardless of the species and origin of the isolates, showed the infective potential of Fusarium spp. in different plant species. Moreover, the pathogenicity tests in the murine model revealed behavioral changes. It was noteworthy that only five isolates (different origin and species) caused mortality. Additionally, it was observed that all isolates infected and colonized different organs, regardless of the species and origin of the isolates or host immune status. In contrast, the superficial inoculation test showed no evidence of epidermal injury or colonization. The observed results in plant and murine models suggest the pathogenic potential of Fusarium spp. isolates in different types of hosts. However, further studies on pathogenicity are needed to confirm the multihost capacity of this genus.
Subject(s)
Animals , Humans , Mice , Fusariosis , Fusarium , Plant Diseases/microbiology , Virulence , Disease Models, Animal , Fusarium/pathogenicity , Mice, Inbred BALB CABSTRACT
Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
ABSTRACT
Se evaluó la actividad enzimática peroxidasa (POD) y el contenido de lignina en tallos de esquejes de clavel (Dianthus cayophyllus L.) inoculados con el hongo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod) raza 2, con el fin de determinar su posible participación en la respuesta de defensa y en la resistencia de la planta al marchitamiento vascular. Inicialmente se seleccionaron las condiciones para la extracción y determinación de la actividad enzimática. Se encontró que el tratamiento con buffer citrato 100 mM pH 5,0 con 3% de PVPP presentó los mejores resultados de actividad peroxidasa para la extracción de la enzima a partir de tallos de clavel. Se determinaron las mejores condiciones para la medida de actividad enzimática POD a través de la reacción de oxidación de o-dianisidina con H2O2 seguida a 460 nm. Una mezcla de reacción con una concentración 0,6 mM de o-dianisidina y 2,0 mM de H2O2 en buffer citrato 100 mM a pH 5,5 y 45°C, presentó los mejores resultados para la cuantificación de la enzima. Una vez establecidas las condiciones, esquejes de clavel de una variedad tolerante y una susceptible al marchitamiento vascular fueron inoculados con el patógeno y se evaluaron los niveles de actividad de POD y de acumulación de lignina a diferentes tiempos pos-inoculación. La variedad tolerante (Bárbara), presentó inducción de dicha enzima a las 8 y 48 h pos-inoculación y aumento en el contenido de lignina a 48 y 72 h. A su vez, en la variedad susceptible (Delphi) no se encontraron cambios significativos en los niveles de POD ni en el contenido de lignina. Se estableció, por tanto, que la inducción de la actividad POD está asociada a la lignificación, que a nivel del tallo, hace parte de los mecanismos asociados a defensa en el modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Peroxidase (POD) enzymatic activity and lignin content in carnation stems (Diant-hus cayophyllus L.) infected with the fungus Fusarium oxysporum f.sp. dianthi race 2 were evaluated with the purpose of determining the possible enzyme participation in the plant defense response and in the resistance to the vascular wilting. Initially, the conditions for extraction and determination of enzymatic activity were selected. It was found that when citrate buffer 100 mM pH 5.0 with 3% PVPP was employed, the results of POD activity in enzyme extract obtained from carnation stems were higher. Best conditions were set for POD activity measure through oxidation reaction of o-dianisidine and H2O2 at 460 nm. A reaction mixture with a concentration of o-dianisidine 0,6mM and H2O2 2.0 mM in citrate buffer 100 mM pH 5.5 at 45 ºC displayed the best results for enzyme quantification. Once conditions were established, tolerant and susceptible vascular wilting carnation cuttings were inoculated with the pathogen. In each treatment at stem level, different postinoculation times were evaluated for enzyme activity levels and lignin accumulation. Tolerant variety (Barbara) showed a POD induction at 8 and 48 h pos-inoculation and an increase in lignin content at 48 and 72 h. At the same time, in susceptible variety (Delphi) there were no significant changes in POD levels or lignin contents. Therefore, it was established that POD activity induction is associated to lignification which, at stem level, is part of the mechanisms associated to defense in carnation (Dianthus caryophyllus L.) against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Foram avaliadas a actividade enzimática peroxidasa (POD) e o conteúdo de lignina em talos de estacas de cravo (Dianthus cayophyllus L.) inoculados com o fungo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2, com o propósito de determinar a sua possível participação na resposta de defensa e à resistência da planta ao murchamento vascular. Inicialmente foram seleccionadas as condiciones para a extracção e determinação da actividade enzimática. Foi encontrado que o tratamento com buffer citrato 100 mM pH 5,0 com 3% de PVPP, apresentou os melhores resultados de actividade peroxidasa na extracção da enzima a partir de talos de cravo. Foram determinadas as melhores condições para medir a actividade enzimática POD a través da reacção de oxidação de o-dianisidi na com H2O2 e com seguimento a 460 nm. Uma mistura de reacção com uma concentração 0,6 mM de o-dianisidina e 2,0 mM de H2O2 em buffer citrato 100 mM a pH 5,5 e 45 °C, apresentou os melhores resultados para a quantificação da enzima. Uma vez estabelecidas as condições, estacas de cravo de uma variedade tolerante e uma susceptível ao murchamento vascular foram inoculadas com o fungo patogénico, e se avaliaram a diferentes tempos pos-inoculação os níveis de actividade desta enzima e de acumulação de lignina. A variedade tolerante (Bárbara), apresentou uma indução de POD às 8 e 48 h pos-inoculação e um aumento no conteúdo de lignina às 48 y 72 h. Por outro lado, na variedade susceptível (Delphi) não se encontraram mudanças significativas nos níveis de POD nem no conteúdo de lignina. Se estabeleceu, por tanto, que a indução da actividade POD está associada à lignificação que a nível de talo faz parte dos mecanismos associados à defesa no modelo cravo-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2.
ABSTRACT
Con el fin de evaluar el comportamiento a nivel del tallo de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, por su nombre en inglés phenylalanine ammonia liase), durante la interacción clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2, se seleccionaron las condiciones para su extracción y cuantificación de la actividad. Para la extracción a partir de tallos y raíces se seleccionó un tratamiento previo del material vegetal con acetona y posterior extracción con buffer borato pH 8,8 con EDTA 2mMy ß-mercaptoetanol 18 mM. Para su cuantificación a nivel del tallo se debe realizar un ensayo discontinuo por 10 min, a 37 oC, pH 8,0 y a una concentración de sustrato de 35 mM. Adicionalmente se muestra mediante un ensayo in vivo el efecto que tiene, como inductor de esta enzima, la aplicación de un extracto crudo del patógeno. Los resultados observados indican que esta enzima se induce significativamente en tallos de claveles de la variedad tolerante Kiss durante el tratamiento por aspersión con el extracto crudo del patógeno, mientras que dicha inducción fue inexistente para la infección directamente con el patógeno. La inducción en esta variedad indica que en este extracto del patógeno se presentan elicitores potenciales para la inducción de esta enzima y por ende de la ruta fenilpropanoide.
The conditions of extraction and quantification of activity during interaction of carnation and Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 were selected to evaluate the dynamics of the enzyme Phenylalanine Ammonium Lyase (PAL) at the carnations steam. For the extraction from roots and stems a previous treatment with acetone and extraction with borate pH 8.8, EDTA 2 mMand mercaptoethanol 18 mM buffer were selected. For the quantification at steam level a discontinous assay for 10 min at 37 °C, pH 8.0 and substrate concentration 35mMshould be done. In addition an in vivo assay shows the effect that the applications of a raw extract of the pathogen as inductor of this enzyme. The results show that the enzyme is significantly induced in carnations stems of the tolerant variety Kiss during the treatment by aspersion with raw extract of the pathogen while the induction was non existing for direct infection with the pathogen. The induction in this variety shows that in the pathogen extract are present elicitors for the induction of this enzyme and thus the phenylpropanoid path.
Para avaliar o comportamento da enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, pelo seu nome em inglês phenylalanine ammonia liase) no caule durante a interação cravo- Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2, foram seleccionadas as condiçes ideais para a sua extração e quantificação na atividade. Para a extração a partir de caules e raízes foi seleccionado um tratamento prévio do material vegetal com acetona e posterior extração com borato pH 8,8 com EDTA 2 mMe ß-mercaptoetanol 18 mM. Para a quantificação da enzima no caule, deve-se realizar um ensaio descontínuo por 10 min., a 37 °C, pH 8,0 e a uma concentração de substrato de 35 mM. Além do mais, mostra-se mediante um ensaio in vivo, o efeito que tem como inductor desta enzima a aplicação de um extracto cru do patógeno. Os resultados observados indicam que esta enzima é induzida significativamente en caules de cravos da variedade tolerante Kiss durante o tratamento por aspersão com o extrato cru do patógeno, enquanto que esta indução foi inexistente para a infecção directa com o patógeno. A indução apresentada nesta variedade indica que neste extrato do patógeno estão presentes potencias elicitores para a indução desta enzima e portanto da rota fenilpropanoide.
ABSTRACT
Se purificó y caracterizó bioquímicamente la enzima polifenoloxidasa (PFO) inducida en tallos de clavel (Dianthus caryophyllus L) de variedad tolerante por inoculación con el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 (FOD2), causante del marchitamiento vascular. La purificación se logró a través de procesos sucesivos de cromatografía en columna de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica y de exclusión molecular. A través de éstos se logró un factor de purificación de 314 veces con respecto al extracto inicial. La proteína purificada mostró actividad PFO y una única banda en SDSPAGE correspondiente a 40 kDa. Usando catecol como sustrato, se determinó su temperatura óptima en 45 ºC y su pH óptimo en 7,5. La enzima presentó una cinética tipo MichaelisMenten con un valor Km de 249 mM y Vmáx 322 U/min. El punto isoeléctrico (PI= 5,0) permitió establecer que se trata de una proteína de tipo ácido. Con la enzima purificada se realizaron ensayos in vitro de actividad fungitóxica, usando sus productos de reacción enfrentados al hongo FOD2, encontrándose una actividad inhibitoria importante de cerca del 57% a las 24 horas, lo que permite postular su papel en los mecanismos de defensa del clavel contra este patógeno vascular.
Polyphenoloxidase (PPO) was isolated and purified from stems of carnation (Dianthus caryophyllus L) after the inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 (FOD2) of a tolerant variety. Purification was performed using column chromatography of ionic exchange, hydrophobic interaction and molecular exclusion. With these successive steps, a factor of 314 fold purification was achieved. The SDSPAGE analysis showed one band of 40 kDa. The purified enzyme was partially characterized using cathecol as substrate and determined the optimal temperature as 45ºC and 7.5 as optimal pH. The enzyme showed a MichaelisMenten kinetic with Km of 249 mM and Vmax 322 U/min. The IP was 5.0 indicating the acidic character of this protein. Using the purified enzyme and its reaction products, in vitro fungitoxic assays were realized indicating an important inhibitory activity against FOD2 of 57% at 24 hours. Then, it is possible to postulate that this enzyme is activated as a part of the defense mechanisms in this interaction model.